[أسامة صلاح]

حتى تاريخ 1970 ميلادية كان إجراء الأبحاث على الحمض النووي ( الدي إن أي)من أصعب الأمور التي كانت تواجه علماء الوراثة و الكيمياء.و كانت معظم الأبحاث تجرى بشكل غير مباشر على الحمض النووي الريبوزي (الأر إن أي)أو البروتين.و لكن الحال تحول بشكل كامل فأصبح علم الوراثة المتعلق بفحص الدي إن أي(و المعروف بعلم الوراثة الجزيئية)من أسهل العلوم و أكثرها تطورا.لقد أصبح من السهل صنع نسخ عديدة من أي جين (مورث) أو مقطع محدد من الدي إن أي.كما أمكن معرفة تسلسل الأحماض النووية بسرعة تتعدى المئات في اليوم الواحد.كما استطاع العلماء استكشاف الجينات الموجودة في على الكروموسومات كما استطاعوا تغيير و تعديلها بشكل الذي يريدون و ليس هذا فحسب بل استطاعوا أن يعيدوا هذه الجينات المعدلة إلى الخلية و غرزها في الكروموسوم الذي يريدون.كما أمكن إنتاج كميات كبيرة من البروتينات كالهرمونات و اللقاحات المختلفة و التي كانت تنتج في السابق من الجثث الميتة أو تستخلص من الحيوانات و التي كانت تحوفها المخاطر من انتقال العدوى إلى الإنسان.كما أن هذه الثورة العلمية فتحة المجال أمام الكثيرين من محبي هذا العلم في اختراع و اكتشاف طرق جديدة و حديثة في التعامل و حفظ و تغيير هذه المادة الحيوية في الإنسان و الحيوان و النبات.لقد غير هذه العلم المنطلق كالصاروخ الكثير من المفاهيم الطبية و التي دفعة كثير من كليات الطب إلى تعديل مقرراتها لتزويد طلابها بالمزيد من هذا العلم.

لقد أُطلق على عملية نسخ و تعديل و زرع الجينات اسم الهندسة الوراثية و هو اسم عام لا يحدد فكرة معينة أو تقنيه محدده، ولكنه يعني بكل ما يقام به في تغيير أو تعديل المادة الوراثية.و يتفرع من هذا العلم الكثير من التقنيات و هي متناثرة و موزعة على الكثير من فروع الطب و العلوم.و ليس للحصر إليك أهم 6 تقنيات تختص بالهندسة الوراثية:

1-قص و قطع الحمض النووي(Cleavage of DNA ) بمقصاة خاصة تسمى (Restriction Nucleases )و اكتشاف هذه المقصاة ساعد كثيرا في مهمة التحكم في الدي إن أي.

2- فصل قطع الدي إن أي على لوح من الجل بالكهرباء (Gel Electrophoresis ).

3-معرفة التسلسل النووي(DNA sequencing ) لكل قطع الدي إن أي التي يتم عزلها بشكل سريع و دقيق.و التي تسمح للعلماء معرفة التركيب الإنشائي للجينات و معرفة و استنتاج نوع البروتين الذي ينتج منه.

4- تقنية تهجين الحمض النووي(Nucleic acid hybridization )، و التي مكنتنا في معرفة أحجام القطع من الحمض النووي و الكشف عن القطع المحددة من الحمض النووي في خليط معقد من القطع المتشابهة.

5-استنساخ الدي إن أي(DNA cloning )، و التي تسمح بإنشاء نسخ عديدة و متطابقة من القطع الدي إن أي.

6-تقنية هندسة أو تعديل الدي إن أي (DNA engineering )، و التي تسمح بإنتاج نسخة معدلة من جين ما ثم أعادته مرة أخرى إلى الخلية.



قص و قطع الحمض النووي:

كما هو معروف فان البروتينات موجودة داخل الخلية على شكل قطع منفصلة عن بعضها البعض و هذا بالطبع سهل عملية فصلها عن بعضها البعض بطرق فنية مناسبة.ولكن الجينات موجودة على الكروموسومات على شكل حبات متصلة ببعضها البعض و ليست على شكل قطع منفصلة.وهذا التسلسل و الترابط في الجينات جعل عملية فصله و عزل و استخلاص جين محدد من بقيه الجينات مهمة صعبة ان لم تكن مستحيلة قبل عام 1970.

ولكن اكتشاف الإنزيمات القاطعة(Restriction Nucleases ) ساعد في عملية استخلاص الجينات و قطع الدي ان أي و نسخها .

الإنزيمات القاطعة (Restriction Nucleases )

لا شك أن كل كائن حي لديه طرق دفاع مختلفة تحميه من غارات الأعداء و هجوم المعتدين! و البكتيريا هي إحدى هذه الكائنات و لها أعداء كثر و من أهم أعدائها الفيروسات المختلفة.و لقد قامة بعض من البكتيريا بإنتاج خمائر(إنزيمات) مهمتها تدمير الفيروسات.و من هذه الإنزيمات الإنزيمات القاطعة أو (Restriction Nucleases).و تقوم هذه المقصاة أو القواطع بقص الحمض النووي(الدي إن أي)للفيروس و بذلك يشل عمله و يبطل مفعولة. و بما أن الدي إن أي مادة موجودة بشكل طبيعي في البكتيريا كما هو الحال في الفيروسات و الكثير من الكائنات الحية فان هذه المقصاة قد تشكل خطرا على البكتيريا نفسها في قصها لدي إن أي الخاص بها.ولكن هذا لا يحدث و السر في ذلك هو قيام البكتيريا بتحوير أجزاء من الدي إن أي الخاص بها عن طريق إضافة مجموعة الميثيل( Methyl) إلى بعض الأحماض النووي من نوع الادنين او السيتوسن(Methylation at an A or a C residue ) فلا يستطيع المقص أو القاطع من قص الحمض النووي الخاص بالبكتيريا.و عند اكتشاف هذه القواطع في السبعينيات الميلادية بدأ العلماء في استخدامها كمقصاة لقص الدي إن أي .و ساعدتهم هذه المقصاة في عملية التحكم في الدي أن أي.و يوجد حاليا أكثر من مائه نوع من هذه المقصاة.و تقسم هذه المقصاة إلى نوعين رئيسيين، النوع الأول يقص شريط الدي إن أي المزدوج بشكل رأسي مستقيم(Blunt ends) و النوع الثاني يقص بشكل متعرج(Staggered cuts, ) و بتالي يجعل طرفي الدي إن أي المقطوع مادة قابلة "للزق"قطعة غريبة من الدي أن أي فيها.و عن لزق قطعة من الدي إن أي في داخل الفراغ الناتج من القطع ينتج لنا قطعة مركبة من قطعتين مختلفتين من الدي إن أي و هذه القطعة تسمى دي إن أي مهجّن أو (Recombinant DNA).

كيف يتعرف الإنزيم القاطع على المكان المفترض أن يحدث القطع فيه؟

كل إنزيم قاطع يعتبر عن مقص خاص لقطع الدي إن أي في نقطة محددة.و يتعرف الإنزيم القاطع على مكان القطع حسب تسلسل الدي إن أي للقطعة.فكل إنزيم قاطع يقطع في تسلسل محدد.فمثلا الإنزيم القاطع المعروف بالهيبا و احد(Hpa I )يقطع عندما يجد 6 من الأحماض النووية في هذا التسلسل ( GTTAAC) بينما الإنزيم القاطع إيكو أر واحد (Eco RI ) يقطع عندما يجد 6 من الأحماض النووية في هذا التسلسل( GAATTC).و للمعلومية فان هيبا واحد سمي بهذا الاسم لأنه يوجد في بكتيريا الهيموفلس بارا انفلونزا (Hemophilus parainfluenzae ) و هذا الإنزيم يعتبر من الإنزيمات التي تقطع بشكل رأسي مستقيم.بنما انزيم الايكو ار واحد فهو مأخوذ من بكتيريا الايكو كولي (Escherichia coli )، ويعتبر من الإنزيمات التي تقطع بشكل متعرج.




القطع المحددة (Restriction fragments ):

عندما يضاف الإنزيم القاطع إلى محلول به شريط من الدي إن أي فانه يقطّعه إلى عدة قطع و ليس إلى قطعتين فقط.و كل قطعة مقطوعة بالإنزيم تسمى قطعة محددة.و يختلف طول هذه القطع على حسب المسافة التي بين كل مقطع و أخر.و لكن يجب أن تكون كل قطعة محددة لها نفس الحجم في كل نوع من الكائنات الحية.و ذلك يعني أن جميع الناس(الإنسان)لديه قطعة محددة معينه يقطعها الإنزيم القاطع هيبا واحد في الكروموسوم رقم 2.و يمكن التأكد من ذلك بتحليل قياس لهذه القطعة بتقنيه حركة الدي إن أي الكهربائية على الجيل(انظر موضوع حركة الدي إن أي الكهربائية في الجل( Gel Electrophoresis).و إذا لم حدث أن وجد إنسان ليس لديه نفس الحجم المفترض للقطعة ففي هذه الحالة نستنتج أن هذا الشخص لدية طفرة(تغير في تسلسل الدي إن أي)في احد الأماكن التي كان من المفترض أن يقصها الإنزيم فلم يتم القطع فيها.و بذلك فان حجم القطعة قد اختلف تعرف هذه الظاهرة عند علماء الوراثة بتفاوت القطع المحددة المصحوب بطفرة(Restriction Fragment Length polymorphism. RFLP )




خريطة القطع المحددة RFLP's Map

لقد أنشاء العلماء خريطة تسمى خريطة القطع المحددة لكثير من الكائنات الحية.و هذه الخريطة تبين مكان القطع و محلها مقارنة بالقطع الأخرى .و عملت هذه الخريطة عن طريق تقطيع جميع الكروموسومات بإضافة أنواع مختلفة من الإنزيمات القاطعة ثم رتبت هذه القطع بشكل منتظم.و كان الهدف من هذه الخريطة هو لتحديد نقاط و علامات على طول الشريط الطويل من الدي إن أي التي تتركب منه الكروموسومات و لكي يستطيعوا أن يقارنوا بين هذه القطع في الكائنات المختلفة.



فصل قطع الدي إن أي على لوح من الجل بالكهرباء(Gel Electrophoresis)

استعمل العلماء تقنية فصل البروتينات عن بعضها البعض بطريق انتقالها(رحلان) و انفصالها عن بعضها البعض، و ذلك عن طريق تعريضها إلى تيار كهربائي و هي على لوح من المادة الهلامية المعروفة بالجل.ولقد استعمل العلماء نفس الفكرة في فصل قطع الدي إن أي عن بعضها البعض.ومن المعروف أن الحمض النووي عبارة عن شحنة سالبة و لذلك فعند و ضع بعض من الدي إن أي في طرف من أطراف لوح الجيل ثم وتعريضها لتيار كهربائي بحيث يكون القطب السالب عند الطرف الذي وضعنا فيه الدي إن أي و القطب الموجب عن الطرف الأخير من ألواح فان الدي إن إي ينتقل تلقائيا بتجاه الطرف الذي فيه

القطب الموجب و تتوقف حركة قطع الدي إن أي على حسب إحجامها على طول اللوح.فالقطع الصغيرة تتحرك بشكل اكبر من القطع الكبيرة. و بذلك يمكن فصل هذه القطع عن بعضها البعض.و يمكن تحديد ا لحجم الفعلي لكل قطعة عن طريق إضافة قطع معروفة الحجم من الدي إن أي و التي تكون مقياس يرجع إليه لاستنتاج أحجام القطع.

وهناك نوعان أساسيان من ألواح الجيل.الأول يسمى بجيل الاقروز (Agarose gel ) و الثاني بجيل البولي اكريليميد(Polyacrylamide gel ).و نظرا لصغر الفراغات التي بين البولي اكريليميد فانه يستخدم لفص القطع الصغيرة الحجم من الدي ان أي و في العادة التي تكون اصغر من 500جزيء من الحمض النووي و التي تتفاوت بين بعضها البعض بجزيء أو جزيئين (انظر الرسم A)..بينما يستخدم الاقروز للأحجام الأكبر من الدي إن أي. و التي يتراوح حجمها بين 300 إلى 10000 جزيء من الدي إن أي (انظر الرسم B)..ومادة الاقروز هي مادة سكرية مستخرجة من الطحالب و عند تحضيرها فإنها تشبه في قوامها الجيلاتين الذي نأكله و لكنها أقوى في قوامها بعض الشيء و لكنها قابلة للتهتك أو الانقطاع عند نقلها بغير حرص.

و لقد واجهه العلماء صعوبات في فصل القطع الكبيرة من الدي إن أي و ذلك لان هذه القطع و عند وضعها على جيل الاقروز و بعد تسليط التيار الكهربائي عليها تتوقف لأنها تتمدد بشكل متعرج على شكل ثعبان ملتوي طرف باتجاه القطب السالب و الأخر بتجاه القطب الموجب.و لقد حلت هذه المشكلة عن طريق تعريض جل الاقروز إلى مستويات متفاوتة من القوة الكهربائية على طول اللوح و بذلك فان قطعة الدي إن أي الطويلة عندما تتعرض إلى تيار كهربائي مختلف يجعلها تعدل من تمددها المتعرج قبل أن تدخل في التيار الكهربائي الجديد و يستمر هذا التفاوت في التيار و التعديل في قوام القطعة حتى تصل إلى المكان الذي يجب أن تقف فيه حسب حجمها. و يسمى هذا النوع من الفصل بالفصل عن طريق المجال الكهربائي المتردد (Pulsed-field gel electrophoresis ).و أمكنت هذه التقنية من فصل قطع كبيرة من الدي إن أي و حتى فصل قطع من الكروموسومات على الجل و تتراوح القطع التي يمكن فصلها بهذه الطريقة بين 220000 إلى 2.5 مليون جزيء من الدي إن أي (انظر الرسم C).

لا تكون القطع المفصولة بالبولي اكريليميد و الاقروز واضحة للعيان و لذلك فان لوح الجيل يعرض إلى مادة لصباغة الدي ان أي و اشهر هذه المواد هو مادة برميدات الاثيديوم ( Ethidium Bromide )و التي تلمع عند تعريضها للأشعة فوق البنفسجية.و هناك طريقه أكثر دقه لمشاهدة القطع على لوح الجيل و هذه الطريقة تعتمد على إضافة مادة مشعة نووية إلى الدي إن أي قبل أن يوضع على لوح الجيل و لكن هذه الطريقة تحتاج إلى احتياطيات معينه لكي لا تضر بمن يستخدمها.




معرفة التسلسل النووي(DNA sequencing )

لا شك أن العلماء يحتاجون إلى معرفة التركيبة التسلسلية لكل جين و هذا يمكنهم من معرفة المزيد عن البروتين الذي يصنعه ذلك الجين وعن التركيبة التنظيمية لعمل الجين و قد يصلون على ضوءه إلى معرفة الأمور التي تتحكم في عمله.كما انه بمعرفة التسلسل النووي للجين يمكن مقارنته بالجينات التي سبق اكتشافها و هذا قد يعطي معلومات غزيرة عن وضيفة هذا الجين و يختصر الكثير من الابحاث

و يتجنب اعادة اجرائها.وهناك طريقتان أساسيتان لمعرفة التسلسل النووي لأي قطعة من الدي إن أي.الأولى تسمى بالطريقة الإنزيمية (Enzymatic method ) و الأخرى بالطريقة الكيميائية(Chemical ).و لقد طغت الطريقة الأولى حتى أصبحت هي الطريقة الأكثر استعمالا.

الطريقة الإنزيمية (Enzymatic method ):
يطلق على هذه الطريقة أيضا طريقة سنجر (Sanger procedure )نسبة إلى د.فريدريك سنجر و الذي أسس هذه الطريقة.كما أنها أيضا تعرف التسلسل عن طريق دي ديوكسي (dideoxy sequencing).و تترتكز هذه الطريقة على مفهوم أن شريط الدي إن أي في الأساس مبنى من جزيئات من الديوكس


يختلف الديوكسي نيوكلويتيد عن دي ديوكسي بيوكلوتيد بعدم و جود مجموعة (هيدروكسي)في النقطة الثالثة من حلقة السكر الخماسية الشكل.

نيوكلويتيد (deoxynucleotides (dNTPs )و يوجد على النقطة الثالثة من حلقة السكر الريبوزي مجموعة مؤكسدة أي مجموعة هيدروكسيه( OH)و هذه النقطة هي التي ترتبط في النقطة الخامسة من الجزيء الذي يليها و هكذا يتم الترابط لتكوّن شريط طويل من الدي إن أي.و لقد قام د.ستنجر بالاستفادة من هذه الخاصية فبدّل الجزيء من (OH)إلى (H ) عن طريق إضافة دي ديوكسيو بيوكلوتيد(ddNTPs) بدل من ديوكسي نيوكلوتيد(dNTPs ) و ذلك عن طريق نسخ الشريط مرة أخرى و هذا يؤدي الى توقف ترابط الجزيئات و يكون في طرف كل جزيء نوع واحد من الأحماض النووي



الناقلات ( Vectors)

الناقل و التي تسمى باللغة الإنجليزية "فيكتور" هي في الغالب فيروسات أو قطع من الحمض النووي موجودة في البكتيريا.كما أن هناك أنواع صناعية تم صنعها في المختبرات الطبية و هي في العادة مواد شبه صناعية لأنها في الأصل مصنعة من مواد موجودة في الطبيعة.و من لديهم اهتمام بالبروتكولات و الطرق التعامل مع هذه الناقلات اقترح عليك مراجعة هذه الصفحة ولاتي تحتوي على العديد من الروابط المتعلقة بالعناية بالناقلات ( اضغط هنا )

البلازميد ( Plasmid )

و هي من اشهر الناقلات ،و هو عبارة عن قطعة صغيرة من الحمض النووي قابلة للتكاثر بمعزل عن بقية الحمض النووي الموجود في الكروموسومات .و هي شبيهة بالفيروس الصغير و لكنها لا تحتوي على طبقة خارجية من البروتين.

. و البلازميد عبارة عن قطعة من الحمض النووي موجود في البكتيريا خاصة في الاي كولي(E.Coli) و بعض أنوع الخميرة ( Yeast) .و لدية القدرة على التكاثر الذاتي و بمعزل من بقية الكروموسومات

الموجودة في الخلية.كما أن هناك بلازميدات تستطيع التكاثر داخل البكتيريا و الخميرة في آن واحد. و يوجد نوعان من البلازميد على حسب نوع الحمض النووي فيها فهناك البلازميد المصنوع من الدي إن أي (DNA ) و نوع أخر مصنوع من الأر إن أي (RNA ). و هناك أنواع عديدة من البلازميد فمنها الصغير و منها الكبير كما أن منها ما لا يحتوي على أي جين بينما هناك أنواع كبيرة تحتوي على عدة جينات.و بالإضافة إلى وحدة التكاثر الذاتي الموجد على البلازميد هناك الكثير من الجينات التي قد تكون على البلازميد و هي مفيدة للعلماء في عملية نسخ الجينات و القطع النووية فمثلا فد يوجد على البلازميد جين خاص يكافح المضادات الحيوية كالمبيسيلين و التترسيكلين .و هذه الجينات الحامية من المضادات الحيوية تساعد في التعرف و عزل البكتيريا التي تحتوي على البلازميد الذي عليه الجين الذي كنا ننوي استنساخه (للمزيد راجع عملية نسخ الجينات و القطع النووية)و يعتقد نظريا أن الفيروسات المنتشرة في الأصل كانت بلازميدات حيث أنها اكتسبت غلاف بروتيني خارجي و أصبحت فيروساً.

[شذرات]

الف شكر لك أخوي أسامة على موضوعك القيم
من جد الله يعطيك العافية عالموضوع اللي نفعتني به كثير لأني أبحث في الموضوع نفسة وبالخصوص عن ..

Restriction Fragment Length polymorphism. RFLP

بس أخوي ولا عليك أمر إذا من الممكن تزودني بالمراجع الا رجعت لها في كتابة الموضوع أكون لك من الشاكرين

وعموماً مشكور مرة ثانية

تحياتي ،،

[أسامة صلاح]

أحاول أجيب لك المراجع بأذن الله